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細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒  

Ver 20260118-3.0

● 產(chǎn)品簡介

細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒提供了一種比較簡單、方便地從培養(yǎng)細(xì)胞或組織中抽提細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞漿蛋白的方法。抽提的膜蛋白不僅包括質(zhì)膜上的膜蛋白，也包括線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和高爾基體膜（不包含核膜）等上的膜蛋白。

本試劑盒通過膜蛋白抽提試劑A通透細(xì)胞，經(jīng)低速離心沉淀去除細(xì)胞核和少數(shù)未破碎的細(xì)胞，隨后取上清高速離心獲得細(xì)胞膜沉淀和含有細(xì)胞漿蛋白的上清，然后通過優(yōu)化的膜蛋白抽提試劑B（含去垢劑）從沉淀中抽提獲取膜蛋白。

約90分鐘即可完成培養(yǎng)細(xì)胞或組織的細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白的分離和抽提。抽提得到的蛋白可以用于SDS-PAGE，Western、酶活性測定等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

由于提取的膜蛋白樣品中含有去垢劑，不建議用于非變性電泳（BN電泳，Tris-甘氨酸非變性電泳，Bis-Tris非變性電泳）。

本試劑盒按照本說明書的操作步驟，如果每次使用細(xì)胞的數(shù)量為2-5×10⁷或組織重量為100 mg，本試劑盒可以提取50個樣品。

● 產(chǎn)品組成

● 貯存、效期和運(yùn)輸：

-20℃貯存；有效期一年；試劑盒濕冰運(yùn)輸。

● 用前必讀：

1. 離心機(jī)請調(diào)整成RCF/g模式，按照離心力設(shè)置離心機(jī)（不要根據(jù)轉(zhuǎn)速rpm模式設(shè)置），所有離心步驟都需要在4℃低溫離心機(jī)中進(jìn)行。

2. 將膜蛋白抽提試劑A和B溶化混勻后放置于冰上預(yù)冷。

3. 蛋白提取推薦添加蛋白酶抑制劑（自備，試劑盒不提供），根據(jù)蛋白酶抑制劑母液濃度提前添加在膜蛋白抽提試劑中（如抑制劑母液是 100×，添加時按照1:100添加，即1ml膜蛋白抽提試劑添加10μl抑制劑）。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自備，試劑盒不提供）。

● 實(shí)驗(yàn)流程圖：

● 使用方法：

自備材料：

1×PBS；臺盼藍(lán)染色液；蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑；剪刀或刀片；冰；1.5 ml離心管。

1. 準(zhǔn)備溶液：

混勻膜蛋白抽提試劑，立即放置在冰上。取適當(dāng)量的溶液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑（自備，試劑盒不提供），隨后立即放于冰上待用。

2. 準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣品：

2.1細(xì)胞樣品：

2.1.1 對于貼壁細(xì)胞：

培養(yǎng)約2000-5000萬（2-5×10⁷）細(xì)胞，細(xì)胞用PBS漂洗一遍，棄PBS；再加入適量PBS，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，或用0.02% EDTA（0.5 mM）溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。400 g（~2000 rpm） 4℃離心5 min收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需提取的目的蛋白。

2.1.2 對于懸浮細(xì)胞：

培養(yǎng)約2000-5000萬（2-5×10⁷）細(xì)胞，400 g（~2000 rpm）4℃離心5 min收集細(xì)胞，用PBS洗一遍，離心收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。

2.1.2 細(xì)胞預(yù)處理（關(guān)鍵步驟）：

把1 ml膜蛋白抽提試劑A加入細(xì)胞沉淀中，輕輕并充分懸浮細(xì)胞，4度旋轉(zhuǎn)混勻10分鐘或冰浴10分鐘（間歇顛倒輕柔混勻3次）；不要劇烈渦旋震蕩。

注：此步驟是通透細(xì)胞膜，可以用臺盼藍(lán)染色快速判斷通透是否合適，取10 μl裂解溶液加等體積臺盼藍(lán)染色液，染色后大多數(shù)細(xì)胞應(yīng)臺盼藍(lán)陽性（藍(lán)染主要局限在細(xì)胞輪廓內(nèi)；細(xì)胞輪廓完整，細(xì)胞仍是規(guī)則圓形/橢圓形；看不到大量碎片或彌散染料）；避免通透過度：一旦出現(xiàn)大量細(xì)小顆粒，看不到細(xì)胞輪廓，出現(xiàn)“藍(lán)點(diǎn)霧化/碎片云”就是通透過度，此時會導(dǎo)致膜漿交叉污染。

2.2組織樣品：

2.2.1 組織漂洗：取約100 mg新鮮組織，用1×PBS清洗兩次，棄凈清洗液。

2.2.2 組織破碎（關(guān)鍵步驟）：用剪刀或刀片盡量小心剪切成細(xì)小的組織碎片，置于1.5 ml離心管中，先加入0.5 ml膜蛋白抽提試劑A，輕輕懸浮組織碎片；用塑料研磨杵在1.5 ml離心管中旋轉(zhuǎn)研磨組織2-5次，至組織成為勻漿懸浮液，再補(bǔ)加入0.5 ml 膜蛋白抽提試劑A，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)研磨2-3次，每100 mg組織需要使用1 ml抽提試劑A。

注：此勻漿步驟為關(guān)鍵環(huán)節(jié)，質(zhì)地較軟的組織如肺，肝臟，腎臟，腦組織推薦使用配套的塑料研磨杵研磨組織。質(zhì)地硬的組織如肌肉組織可以使用玻璃勻漿器勻漿。如果使用玻璃勻漿器勻漿，要使用松散型間距的玻璃勻漿器，因?yàn)榫o致型間距的玻璃勻漿器極易導(dǎo)致組織勻漿過度。勻漿次數(shù)原則是寧少勿多，建議初始勻漿次數(shù)2-3次，過度勻漿會導(dǎo)致膜漿交叉污染。破碎效果與組織細(xì)胞類型有關(guān)，不同的樣品所需勻漿次數(shù)不同。鑒定方法：取10 μl勻漿后的樣品，加入等體積的臺盼藍(lán)溶液，混勻，在顯微鏡下觀察臺盼藍(lán)溶液染色陽性（藍(lán)色）細(xì)胞數(shù)目的比例，當(dāng)陽性（藍(lán)色）細(xì)胞破碎達(dá)到80%即可停止勻漿，請勿過度勻漿。若陽性（藍(lán)色）細(xì)胞比例未達(dá)到80%，適當(dāng)增加1-2次勻漿，隨后按照同樣的方法使用臺盼藍(lán)溶液進(jìn)行鑒定。

2.2.3 勻漿后的懸液4度旋轉(zhuǎn)混勻10分鐘或冰浴10分鐘（間歇顛倒輕柔混勻3次）；不要劇烈渦旋震蕩。

3. 去除細(xì)胞核：

將細(xì)胞處理液或組織勻漿液700 g（~2700 rpm） 4℃離心10分鐘，小心將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml離心管中。注：轉(zhuǎn)速不要超過700 g，否則會降低膜蛋白的得率。

關(guān)鍵步驟：吸取上清時不要觸及沉淀，可以只吸取80%體積上清，以免上清中污染核蛋白。此步驟得到的細(xì)胞核純度不高，混雜有沒有完全破碎的完整細(xì)胞，不建議用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

4. 沉淀膜蛋白：

上清溶液16000 g（~13000 rpm） 4℃離心15分鐘，沉淀即為提取的膜蛋白。

5. 收集胞漿蛋白：

5.1小心吸取上清置于1.5 ml離心管中，吸取上清時可以有30-50微升上清殘留，以避免接觸沉淀導(dǎo)致胞漿蛋白中污染膜蛋白。

5.2 為提高胞漿蛋白純度，上清溶液16000 g（~13000 rpm） 4℃再次離心15分鐘，收集上清即為最終的胞漿蛋白，可-70℃保存?zhèn)溆谩?

注：每5000萬細(xì)胞使用本產(chǎn)品裂解可獲得5-30 mg細(xì)胞漿蛋白, 不同細(xì)胞有所不同。

6. 抽提膜蛋白：

6.1 膜蛋白漂洗：

去除步驟4膜蛋白沉淀中殘余的上清，加入預(yù)冷的1 ml 1×PBS懸浮沉淀，4℃，16000 g（~13000 rpm）離心5 min，去除上清；重復(fù)漂洗一次。

注：此步驟能去除粘連在膜蛋白表面的胞漿蛋白，提高膜蛋白的純度。

6.2 膜蛋白溶解：

盡最大努力吸盡上清（可以輕輕觸碰到沉淀，甚至吸走很少量的沉淀）。加入100微升膜蛋白抽提試劑B，移液器輕輕吹打多次以獲得均質(zhì)的懸液，置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上，4°C孵育30 min或者渦旋劇烈震蕩，冰浴處理30 min，間歇劇烈震蕩3-5次。

6.3 膜蛋白收集：

4℃，16000 g（~13000 rpm）離心15分鐘，收集上清即為細(xì)胞膜蛋白溶液。可-70℃保存?zhèn)溆谩?

注：每5000萬細(xì)胞使用本產(chǎn)品裂解可獲得0.3-3 mg細(xì)胞膜蛋白, 不同細(xì)胞有所不同。

7. 膜蛋白樣品處理（變性）：

測定提取膜蛋白濃度，根據(jù)濃度混合細(xì)胞膜蛋白樣品和SDS-PAGE上樣緩沖液，根據(jù)膜蛋白性質(zhì)進(jìn)行變性處理，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。

注：對于多次跨膜蛋白（Multi-pass membrane protein）的變性電泳檢測，樣品建議使用37℃處理30分鐘或者50度處理10分鐘，不要95℃或煮沸加熱處理，因?yàn)樵诟邷厍闆r下，多次跨膜蛋白極易聚集形成多聚體，樣品會聚集，WB檢測會表現(xiàn)為比實(shí)際蛋白大小更大的分子量，如一些ATPase、ABC、SLC、GLUT家族蛋白。

8. 實(shí)驗(yàn)示例：

小鼠肺組織，Jurkat 膜漿分離

提取過程簡述：100 mg冷凍肺組織，PBS漂洗兩次，1 ml 抽提試劑A，玻璃勻漿器勻漿10次（過度勻漿）；1×10⁷ Jurkat 細(xì)胞，PBS漂洗一次，1 ml 抽提試劑A，不勻漿； 4度旋轉(zhuǎn)混勻10 min；700 g去核；上清16000 g 30min，上清為CY，各約0.8 ml，肺組織CY濃度6 μg/μl，Jurkat CY濃度0.7 μg/μl；沉淀PBS漂洗一次，肺組織沉淀中加200 μl 抽提試劑B，Jurkat沉淀加100 μl 抽提試劑B；4度旋轉(zhuǎn)混勻45min，16000 g 15min取上清為膜蛋白M，肺組織膜蛋白濃度3.7 μg/μl，Jurkat 膜蛋白濃度0.3 μg/μl。

電泳：RTD6119-0420 11孔預(yù)制膠Lot#85129006；蛋白上樣20 μl/4 μg

轉(zhuǎn)膜：1×快速轉(zhuǎn)膜液加10%乙醇，恒流400 mA，電壓變化72-60 V 40min

Na-K ATPase抗體：康何欣CMA5242重組兔單抗 1：2000

Calnexin抗體：華安ET1611-86  兔單抗 1：500（煮沸剝離后孵育）

LB1：華安ET1606-27 兔單抗 1：3000

β-Tubulin Abmart M20005S 鼠單抗 1：2500（煮沸剝離后孵育）

GAPDH 華安ET1601-4 兔單抗 1：10000（煮沸剝離后孵育）

COXIV 華安ET1701-63 兔單抗1：3000

1.在組織樣本中過度勻漿會導(dǎo)致線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器與膜碎片和細(xì)胞骨架形成大分子復(fù)合體，從而在低速（700 g）離心條件下與細(xì)胞核共同沉淀。解釋了在肺組織膜蛋白中看不到Calnexin和COXIV；

2.Jurkat 抽提試劑A中可以實(shí)現(xiàn)高度選擇性的質(zhì)膜破裂，使胞漿蛋白主要分布于胞漿組份而膜蛋白富集于膜組份。