單鏈DNA Marker 15-120nt 預(yù)混型
|
貨號
|
名稱
|
規(guī)格
|
|
RTM506
|
單鏈DNA Marker（15-120 nt）
|
10次
|
● 產(chǎn)品組成：
|
貨號
|
名稱
|
規(guī)格
|
貯存
|
|
RTM506-01
|
單鏈DNA Marker（15-120 nt）
|
50 μl
|
-20℃
|
|
DL080-01
|
2×TBE尿素上樣緩沖液
|
1 ml
|
-20℃
|
● 產(chǎn)品簡介：
單鏈DNA Marker由6條不同長度的單鏈DNA分子混合而成，6條帶的大小為15，40，60，80，100，120 nt，80 nt 濃度為0.4 μg/μl，其余條帶濃度為0.2
μg/μl。該Marker適用于跑尿素變性膠，電泳后使用單鏈DNA
PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5102），核酸快速高靈敏度染色試劑盒（Cat：RTS5101）或RealSafe類核酸染料染色均可以得到清晰的條帶分離效果。
樣品保存在1×TBE尿素上樣緩沖液中，上樣方便。以每次上樣5 μl計算，該單鏈DNA
Marker可以使用大約10次。
● 保存條件和運輸：
-20℃貯存，有效期24個月；濕冰運輸。
● 使用方法：
注：以下使用方法均以8×10cm凝膠 厚1.0mm示例，其他規(guī)格凝膠請適當(dāng)調(diào)整。
一. 凝膠制備：
1.1 可以選擇DNA尿素PAGE電泳試劑盒（Cat：RTE4102））或按照以下程序制膠：
表一 TBE-尿素PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于厚度1.0 mm小板膠)
|
單鏈DNA長度
|
最佳凝膠濃度
|
尿素（克）
|
40%PAA
（29:1）
|
5×TBE
|
補水到總體積
|
10%APS
|
TEMED
|
|
200-1000 nt
|
5%
|
2.1克
|
0.625 ml
|
1 ml
|
5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
|
50-400 nt
|
8%
|
2.1克
|
1 ml
|
1 ml
|
5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
|
30-300 nt
|
10%
|
2.1克
|
1.25 ml
|
1 ml
|
5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
|
10-150 nt
|
15%
|
2.1克
|
1.875 ml
|
1 ml
|
5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
最后加入10%APS和TEMD后，立即混勻。
1.2在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層，使凝膠表面保持平整。
1.3靜置10-20分鐘，待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個清晰的界面后，說明凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
1.4去除覆蓋在分離膠上的水層；按照表二將不同體積成分在一個小燒杯中混合；最后加入10%過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
表二 TBE-尿素PAGE 4%濃縮配方表 (總體積2 ml，適用于1.0mm厚度膠)
|
|
各組份體積（ml）
|
|
凝膠濃度
|
尿素
|
40%PAA（29:1）
|
5×TBE
|
滅菌水
|
10%APS
|
TEMED
|
|
4%
|
0.84克
|
0.2 ml
|
0.4 ml
|
補水至體積2 ml
|
20 μl
|
2 μl
|
1.5將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端；將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
1.6靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
二. 樣品制備：
2.1
取適量體積單鏈DNA
Marker樣品，70℃處理5分鐘，冰浴制冷后待上樣；待測樣品序與2×TBE尿素上樣緩沖液等體積混合后70℃處理5分鐘，冰浴制冷后待上樣。
三.電泳：
3.1. 預(yù)電泳（可選）：電泳槽內(nèi)外加入適量1×TBE緩沖液穩(wěn)壓200 V預(yù)電泳30分鐘。電泳結(jié)束后，用1×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次，去除殘余的尿素。
3.2.上樣：根據(jù)梳齒確定Marker上樣量， 一般是10齒1mm厚梳子上樣5
μl，15齒1mm厚梳子上樣3
μl。
3.3. 連接電源線，打開電源開關(guān)，按照以下條件電泳。
|
|
恒電壓
|
起始電流
|
結(jié)束電流
|
電泳時間
|
適用條件
|
|
推薦電壓
|
200V
|
15-20 mA/板膠
|
10-15 mA/板膠
|
60+ min
|
最佳電壓，最優(yōu)的分辨率
|
3.4. 等待上樣緩沖液的溴酚藍(lán)指示前沿到凝膠底部時終止電泳，取出凝膠進行后續(xù)實驗。
|
變性膠濃度
|
溴酚藍(lán)
|
二甲苯菁
|
|
5%
|
35 nt
|
130 nt
|
|
8%
|
19 nt
|
75 nt
|
|
10%
|
15 nt
|
55 nt
|
|
15%
|
8 nt
|
42 nt
|
四．染色：
用單鏈DNA PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5102）或核酸快速銀染試劑盒（Cat：RTS5101）染色均可以得到清晰的條帶分離效果。
注：如果使用核酸染料染色，RealSafe
Red（貨號：GR002）或RealSafe
All（貨號：GR004）核酸染料結(jié)合單鏈核酸效果最佳，強烈建議使用以便獲得最佳效果的膠圖。其余染料如GelRed，Goldview，EB等染色效果不好。
● 電泳示例：
1. 使用RealSafe Red核酸染料（貨號：GR002）染色：
2. 使用核酸快速高靈敏度染色試劑盒（貨號：RTS5101）染色：
